藏獒细小病是啥病？
就是肠道感染了，细小的病毒。 犬细小病毒（Canine parvovirus），简称CPV。主要感染犬，引起急性消化道传染病。临床特征为急性呕吐、腹泻、脱水、循环障碍和电解质紊乱。本病全年均可发生，以冬春季多发，1岁以内的幼犬发病率最高。我国已有本病原体的分离与鉴定报告[l]-[3]。最近，我们实验室从患病犬粪便中分离到一株CPV毒株，经PCR扩增，测序分析确认该毒株的基因序列，并与其他报道的CPV毒株的基因序列进行比较。
结果表明：我国部分地区的CPV病毒出现基因变异，对目前常用的疫苗株产生了一定程度的免疫逃逸。研究该地区CPV病毒的基因特性，对于正确指导疫苗使用以及预防该病的复发都有重要意义。 一、材料和方法
（一）实验动物及样品采集45只健康犬，其中北京犬20只，拉萨犬、西藏梗、苏牧各5只，其他品种犬10只；健康豚鼠50只。所有动物由本校动物房提供。
从2007年1月起至3月，共收集可疑患犬粪便标本86份；胃液22份。
（二）试剂dNTPs，Tag酶，RNaseA，DNAMarker，胶回收试剂盒，DEPC水等。
（三）方法
1.引物设计与合成参照文献[4]，利用Primer5软件设计1对特异性引物，用于检测CPV DNA。上游引物P1：CACTGCTAAAGCATACATCAAGCTT，下游引物P2：CAGGGCGTTCACTAGTTGTCTCG。
2.RNA的提取 采用Trizol法提取胃肠道分泌物中的RNA，按说明书操作。
3.逆转录反应 取总RNA1μg，加入随机引物Oligo(dT)18，混匀后70℃保温5min，迅速冷却至室温。
加入5×逆转录缓冲液4μL，Rnase抑制剂（20U/μL）0.5μL，无核酸酶的水溶解至200μL。置RT培养箱中，按以下条件进行逆转录反应：42℃，60min；99℃，5min；5℃，10min。
4.聚合酶链式反应（PCR） 以逆转录产物为模板，加入2μL dNTPs混合液，94℃预变性5min；然后加入5μL Tag酶混合液，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min；最后进行40个循环。
5.克隆与测序 PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检查后，选用大小约为300bp的片段进行回收纯化，连接到PMD18-T载体上，转入感受态细胞DH5α中，涂布于含有氨苄青霉素和IPTG的培养基上，37℃诱导16h，将单克隆挑取培养，送上海生工生物科技有限公司进行序列测定。
二、结果
（一）临床症状 32只犬出现呕吐，呕吐物呈粘液性；6只犬出现腹泻，粪便稀薄含黏液，个别犬粪便带血。所有病例体温均正常。病程1周左右。
（二）病理变化 胃肠粘膜脱落，暴露粘膜下层，腺体萎缩，血管扩张充血，可见点状或带状出血。
（三）化验室检查 6只腹泻犬血清淀粉酶浓度高于正常值（175±95）u/L，白细胞总数升高（20.8±4.3)×109/L。 10只犬粪便常规检验有2～5条虫体，形状如蛔目，色泽黄褐色，头部钝圆，尾部尖细，全身弯折处呈圆形突起，在结肠内虫体大量聚集，相互缠绕成团。
（四）病毒分离与鉴定 从发病较重的3只犬的胃肠道分泌物中分离出病毒，接种于易感动物，均诱发轻型感染，从粪便中再分离到病毒。病毒鉴定结果：该病毒属于肠病毒科，犬细小病毒属。
（五）基因序列测定与分析 从患病犬粪便中分离的病毒株，经RT-PCR扩增后，获得一段长度为305bp 的DNA片段。将该片段送至上海生物技术有限公司进行序列测定。
将得到的序列与已知序列的CPV（GenBank登录号：EF645364）进行同源性比较，二者核苷酸的同源性高达96%以上。据此推测，这些病毒株具有相同的遗传多样性，属于同一个病毒群体。鉴于该病毒对目前广泛使用的疫苗产生免疫逃避，因此必须加强检疫措施，防止该病毒入侵。